كيفية إجراء اختبار ELISA؟

مقايسة المناعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في علم المناعة لاكتشاف وقياس البروتينات المحددة والأجسام المضادة والمستضدات وغيرها من الجزيئات الحيوية في العينات البيولوجية. كمورد ELISA ، أنا على دراية جيدة في هذه العملية وسأرشدك من خلال إجراء اختبار ELISA خطوة بخطوة.

مبدأ إليسا

يعتمد ELISA على مبدأ التفاعل بين الأجسام المضادة. يتضمن المفهوم الأساسي تجميد مستضد أو جسم مضاد على سطح صلب (عادةً ما يكون بئر الصبغ الدقيق) ، يليه إضافة عينة تحتوي على جزيء الهدف. إذا كان الجزيء المستهدف موجودًا في العينة ، فسوف يرتبط بالمستضد أو الأجسام المضادة. بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد للكشف ، والذي مترافق إلى إنزيم. يرتبط الجسم المضاد للكشف بالجزيء المستهدف ، ويشكل شطيرة - مثل المجمع. أخيرًا ، تتم إضافة الركيزة ، ويحفز الإنزيم تفاعلًا ينتج إشارة قابلة للاكتشاف ، وعادة ما يكون تغيير اللون ، يمكن قياسه باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

المواد المطلوبة

• microplate: A 96 - بئر أو 384 - يتم استخدام الألواح الدقيقة بشكل شائع. عادة ما تكون هذه اللوحات مصنوعة من البوليسترين ، والتي لها خصائص ملزمة للبروتين.
• طلاء مستضد أو جسم مضاد: هذه هي الطبقة الأولى التي تم تجميدها على سطح اللوحات الدقيقة. يجب أن يكون خاصا بالجزيء المستهدف.
• منع المخزن المؤقت: لمنع الربط غير المحدد ، يتم استخدام محلول حظر مثل ألبومين مصل الأبقار (BSA) أو محلول مسحوق الحليب.
• عينة: العينة البيولوجية (على سبيل المثال ، المصل ، البلازما ، المحللة الخلية) التي قد تحتوي على جزيء مستهدف.
• الكشف عن الجسم المضاد: هذا الجسم المضاد خاص بالجزيء المستهدف ويترافق مع إنزيم مثل بيروكسيديز الفجل (HRP) أو الفوسفاتيز القلوي (AP).
• غسل العازلة: يتم استخدام المخزن المؤقت (الذي يحتوي عادةً على منظف مثل Tween - 20) لغسل المواد غير المقيدة بين كل خطوة.
• حل الركيزة: بالنسبة إلى HRP ، فإن الركيزة الشائعة هي 3،3 '، 5،5' - tetramethylbenzidine (TMB) ، والتي تتحول إلى اللون الأزرق عند تحفيزها بواسطة HRP ثم الأصفر بعد إضافة محلول توقف. بالنسبة إلى AP ، غالبًا ما يتم استخدام فوسفات النيتروفينيل (PNPP) ، والذي ينتج لونًا أصفر.
• توقف الحل: بالنسبة إلى TMB ، يتم استخدام حمض الكبريتيك أو حمض الهيدروكلوريك لإيقاف التفاعل الأنزيمي.
• Thermo Microplate Shaker: هذا أداة مهمة لضمان الخلط المناسب أثناء خطوات الحضانة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول هذا الموضوعهنا.
• قارئ الألواح الدقيقة: لقياس امتصاص المنتجات الملونة بطول موجة محددة.

الخطوة - بواسطة - إجراء الخطوة

1. طلاء الألواح الدقيقة

• قم بتخفيف مستضد الطلاء أو الأجسام المضادة في المخزن المؤقت للطلاء (عادةً ما تكون كربونات - بيكربونات المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 9.6).
• أضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المخفف لكل بئر من الألواح الدقيقة.
• قم بتغطية الألواح الدقيقة مع سدادات لوحة واحتضانها عند 4 درجات مئوية خلال الليل أو عند 37 درجة مئوية لمدة 2 - 3 ساعات. هذا يسمح للمستضد أو الأجسام المضادة بالربط بسطح البوليسترين للوحة الدقيقة.
• بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق نفض الصفيحة على الحوض. بعد ذلك ، قم بغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسل ، وملء كل بئر مع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسل والحضانة لمدة 3 - 5 دقائق في كل مرة. بعد كل غسل ، نفض الغسيل لإزالة المخزن المؤقت للغسيل واضغطه برفق على منشفة ورقية لإزالة أي قطرات متبقية.

2. الحظر

• أضف 200 ميكرولتر من حظر العازلة إلى كل بئر.
• احتضان الألواح الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة. يملأ المخزن المؤقت للحظر المواقع غير المشغولة على سطح اللوحات الدقيقة ، مما يمنع الربط غير المحدد للبروتينات الأخرى في الخطوات اللاحقة.
• بعد الحظر ، اغسل اللوحة ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للغسيل كما هو موضح أعلاه.

3. إضافة العينة

• تمييع العينة في عينة مخففة إذا لزم الأمر.
• أضف 100 ميكرولتر من العينة إلى كل بئر. تشمل الضوابط الإيجابية والسلبية في آبار منفصلة. تحتوي الضوابط الإيجابية على كمية معروفة من الجزيء المستهدف ، في حين أن الضوابط السلبية لا تحتوي على جزيء الهدف.
• قم بتغطية الألواح الدقيقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة. خلال هذا الوقت ، يرتبط الجزيء المستهدف في العينة بالمستضد أو الأجسام المضادة المثبتة على سطح اللوحات الدقيقة.
• اغسل اللوحة خمس مرات مع المخزن المؤقت للغسل لإزالة المواد غير المقيدة.

4. إضافة الجسم المضاد للكشف

• تخفيف الجسم المضاد للكشف في المخزن المؤقت المخفف.
• أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف المخفف إلى كل بئر.
• احتضان الألواح الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة. يرتبط الجسم المضاد للكشف بالجزيء المستهدف ، ويشكل مركبًا للأجسام المضادة للمستضد - الكشف عن الأجسام المضادة.
• اغسل اللوحة خمس مرات مع المخزن المؤقت للغسيل لإزالة الأجسام المضادة للكشف عن غير محدودة.

5. إضافة محلول الركيزة

• أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة لكل بئر.
• احتضان الألواح الدقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 إلى 30 دقيقة. إن الإنزيم المترافق مع الأجسام المضادة للكشف يحفز تفاعل الركيزة ، مما ينتج عنه منتج ملون.

6. إضافة حل التوقف

• أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. هذا يوقف التفاعل الأنزيمي ويثبت اللون.

7. قراءة النتائج

• استخدم قارئ اللوحات الدقيقة لقياس امتصاص كل بئر في الطول الموجي المناسب (على سبيل المثال ، 450 نانومتر لـ TMB بعد إضافة محلول الإيقاف).
• احسب تركيز جزيء الهدف في العينة من خلال مقارنة قيم الامتصاصية لآبار العينة مع المنحنى القياسي المتولد من عناصر التحكم الإيجابية.

الأتمتة في ELISA

لتطبيقات الإنتاجية العالية ، يمكن استخدام معالجات ELISA الآلية. وAuto ELISA معالجيمكن إجراء العديد من الخطوات مثل الغسيل ، وإضافة الكواشف ، والحضانة تلقائيًا. هذا لا يوفر الوقت فحسب ، بل يقلل أيضًا من احتمال وجود خطأ بشري.

أمعالج ELISA الآلي بالكامليأخذ الأتمتة خطوة إلى الأمام. يمكنه التعامل مع عملية ELISA بأكملها من البداية إلى النهاية ، بما في ذلك إعداد العينة ، وإضافة الكاشف ، والحضانة ، والغسيل ، وتحليل النتائج. تعد هذه الأنظمة الآلية مثالية للمختبرات الكبيرة الحجم حيث يجب معالجة عدد كبير من العينات.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

• خلفية عالية: قد يكون هذا بسبب عدم كفاية الغسيل أو الحظر غير السليم أو تلوث الكواشف. تحقق من خطوات الغسيل ، وتأكد من الحظر المناسب ، واستخدم الكواشف الطازجة.
• إشارة منخفضة: يمكن أن يكون هذا ناتجًا عن انخفاض تركيز الجزيء المستهدف في العينة ، أو التخفيف غير السليم للكواشف ، أو مشكلة في الأجسام المضادة للكشف. حاول تركيز العينة ، والتحقق من تخفيفات الكاشف ، واستخدام مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة للكشف إذا لزم الأمر.
• نتائج غير متناسقة: قد يكون هذا بسبب الخلط غير المتكافئ أثناء الحضانة أو التباين في درجة الحرارة. استخدمThermo Microplate Shakerلضمان الخلط المناسب والحفاظ على درجة حرارة متسقة أثناء الحضانة.

خاتمة

يتطلب إجراء اختبار ELISA اهتمامًا دقيقًا بالتفاصيل والتعامل المناسب مع الكواشف والمعدات. كمورد ELISA ، نقدم مجموعة واسعة من المنتجات عالية الجودة بما في ذلك الألواح الدقيقة ، ومستضدات الطلاء ، والأجسام المضادة للكشف ، والمعدات الآلية لضمان نجاح تجارب ELISA الخاصة بك. إذا كنت مهتمًا بشراء المنتجات ذات الصلة ELISA أو لديك أي أسئلة حول عملية ELISA ، فلا تتردد في الاتصال بنا للمشتريات ومزيد من المناقشة.

مراجع

• Harlow ، E. ، & Lane ، D. (1988). الأجسام المضادة: دليل المختبر. كولد سبرينغ هاربور المختبر مطبعة.
• Voller ، A. ، Bidwell ، De ، & Bartlett ، A. (1979). الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). مختبرات Dynatech.